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1.2.3培养液残留原油的提取、纯化和鉴定

采用重量法测定培养液中残留原油。取培养液使用正己烷萃取至清澈，合并有机相，40℃减压蒸馏除去正己烷得到原油，转移至称量瓶中氮气吹干后称取原油质量。然后称取约0.1g剩余原油通过硅胶柱层析，参考美国EPA.8270E(SW-846)方法进行柱层析分离饱和烃和不饱和烃组分，利用气相色谱质谱(GC-MS)联用仪(TSQ8000Evo美国ThermoScientific公司)分别测定饱和烷烃(包括姥鲛烷、植烷)和多环芳烃组分含量，方法为:取烷烃和芳烃洗脱液利用GC-MS测定，载气为He，载气流速1.0 mL/min;无分流自动进样，进样量1μL;升温程序为50℃保持2min，以6℃/min升温至300℃，保持15 min;进样口和检测器温度分别为280和300℃;质谱检测器采用EI离子源;离子源温度为230℃;定量采用SIM扫描方式。

依据公式(1)计算石油烃降解率:

式中:尘0表示对照培养液中残余油含量(驳·尝-1);尘1表示实验组培养液中残余油含量(驳·尝-1)。

1.2.4槐糖脂的提取、纯化和鉴定

将培养10d后的发酵液经等体积的乙酸乙酯萃取两次合并有机相，利用旋转蒸发仪(RE-52A上海亚荣生化仪器)40℃减压蒸馏除去乙酸乙酯得到黄色粗提产物。粗提产物用薄层层析(TLC)进行初步定性分析，以本实验室由S.bombicola发酵生产纯化后的槐糖脂纯品为标准样。展开剂为氯仿/甲醇/水(65∶15∶2，体积比)。显色剂为苯酚-硫酸试剂，在105℃显色5 min，糖类显棕色斑点。

所提取的产物进一步通过高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用仪进行结构分析，简述如下:取3.0g层析硅胶在110℃的温度下活化4h后，填充到玻璃层析柱中(顶部加入1cm无水硫酸钠)，取0.05~0.1g粗产物溶于2 mL乙酸乙酯/甲醇(10∶1，体积比)混合溶剂中，用40 mL上述混合溶剂洗脱，再通过旋转蒸发仪除去有机相得到槐糖脂纯化品。采用高效液相色谱-高分辨串联质谱联用仪(1290 HPLC-BrukermaXis Q-TOF美国Agilent公司)测定纯化品槐糖脂同系物的组分，色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH130C182.1mm×150 mm×1.7μm。实验条件:流动相A:V(甲酸)∶V(乙腈)∶V(水)=0.1∶1.0∶99.0;流动相B:V(甲酸)∶V(乙腈)=0.1∶100.0;流速为0.2 mL/min。等度洗脱条件为:流动相B的体积分数为80%。柱温:30℃，进样量:1μL，UV检测波长:207nm，无分流进入质谱。质谱条件:电喷雾正离子模式;扫描范围m/Z:200~1000;毛细管电压:4.5kV;喷雾气压10342.5 Pa;干燥气(N2)流速:6L/min;气体温度:80℃;分辨率:50000。

1.2.5菌体细胞电子显微镜观察

通过透射电子显微镜(TEM)观察不同培养阶段S.bombicola细胞结构的变化。在培养第1天和第10天时分别移取添加原油浓度为0.5%的发酵液约10mL，在3500r·min-1，4℃条件下离心15 min后收集菌体。依次用2.5%的戊二醛和1%的四氧化锇固定，30%~100%的乙醇系列脱水，然后用环氧树脂包埋，切片，经醋酸铀，柠檬酸铅双染色后用TEM观察结构变化。

2结果与讨论

2.1菌株翱-13-1对采油废水中石油烃的降解作用

在10诲的降解时间内，接种厂.产辞尘产颈肠辞濒补的降解体系中油污染物被充分乳化分散为小油珠，培养液颜色明显加深，而未接种翱-13-1菌株的对照培养体系原油仍呈块状漂浮于培养液表面。图1表示不同初始油浓度下经10诲降解后的剩余原油量和原油降解率，结果表明，在10诲的降解时间内，与空白对照相比，油浓度为0.3%、0.5%和0.8%的废水中油污染物降解率分别提高了18.0%、16.9%和11.9%，这表明所接种的厂.产辞尘产颈肠辞濒补菌株对废水中原油有明显的强化降解作用，且随废水中油浓度的降低，生物降解率逐渐提高，这与搁补丑尘补苍等的研究结果基本一致。这可能是由于油浓度过高，对降解菌细胞具有一定的毒性，降解菌需要较长的时间适应调整。

正构烷烃的中等碳数(颁17—颁28)组分降解率变化趋势如图2所示。接种厂.产辞尘产颈肠辞濒补的培养体系中各组分下降明显。油浓度为0.8%、0.5%和0.3%的降解体系中正构烷烃降解率分别为7.0%词12.8%、17.9%词44.0%和4.5%词27.7%，表明厂.产辞尘产颈肠辞濒补可对原油中正构烷烃组分进行生物降解。实际上，已有研究表明，厂.产辞尘产颈肠辞濒补可高效降解石油烃中的烷烃类组分。在降解过程中，原油首先被吸附于菌细胞表面。

图1不同初始油浓度下经10诲培养后剩余原油含量和原油降解率的变化

图2油浓度为0.8%(补)、0.5%(产)和0.3%(肠)的培养体系中正构烷烃的中等碳数组分降解率