一、实验目的
本方案分离多株堆肥源功能微生物，进行液体摇瓶培养获取发酵上清，依托芬兰碍颈产谤辞苍?贰辫蝉颈濒辞苍动态界面张力仪、顿别濒迟补?8高通量微孔检测模组，大批量快速测定菌株胞外代谢产物的气?液动态表面张力，筛查可以产出高活性生物表面活性剂的堆肥菌种。
堆肥环境复杂，微生物代谢产生糖脂、脂肽、胞外多糖、脂蛋白等两亲代谢物，可以改变液相界面能、促进疏水有机污染物乳化、提升堆肥基质降解效率。高通量张力筛查能够快速对比上百株菌株上清界面活性，筛选优良菌株，省去复杂的代谢物提纯步骤，适用于堆肥菌种的初筛工作。
二、实验前期准备
1.仪器与耗材准备
核心仪器：碍颈产谤辞苍?贰辫蝉颈濒辞苍动态界面张力仪用于代表性样品精细测定动态吸附曲线；顿别濒迟补?8高通量表面张力分析仪承担大批量菌株快速筛查；配备奥颈濒丑别濒尘测合金探针、帕尔贴恒温样品基座、石英微量样品杯、384孔低吸附微孔板、探针火焰清洁组件、数据采集软件。
辅助设备：超净工作台、恒温振荡摇床、高速冷冻离心机、pH计、0.22 μm水系滤膜、超声清洗仪、无菌离心管、一次性无菌取样管。
实验耗材：从腐熟堆肥分离得到的全部待测菌株、通用微生物液体发酵培养基、磷酸盐缓冲液、酸碱调节剂、18.2 MΩ超纯水、无水乙醇、异丙醇。
仪器预处理规范
整机通电预热30 min，检测温度设置为30 ℃，匹配堆肥微生物适宜生长温度，全程检测温度保持恒定。
金属探针每一次样品检测之前使用丁烷火焰灼烧，灼烧去除黏性胞外多糖、脂类残留物，冷却之后开展基线校准；纯水平衡表面张力稳定处于71.8~72.2 mN/m，基线连续30 min波动小于0.2 mN/m之后方可测试。
微量样品杯、微孔板依次异丙醇擦拭、无水乙醇冲洗、纯水多次润洗之后氮气吹干；操作过程手部不可触碰容器内壁，防止油脂污染气?液界面。仪器放置减震台面，闭合防风防护罩，规避气流扰动以及水分蒸发。
2.菌株培养、实验组搭建以及发酵上清预处理
堆肥菌株活化和批量培养
所有待测堆肥微生物分别进行平板活化，之后转接至液体培养基；每一株菌种设置3组生物学平行摇管，空白对照组为未接种菌株的空白发酵培养基，在相同摇床环境下培养。
培养条件设置固定转速、温度，统一发酵时长，保证所有菌株的培养环境一致，消除培养条件带来的误差。
发酵上清预处理
1.培养结束之后取出菌液，8000 r/min离心15 min，沉降菌体残渣、固体颗粒杂质，缓慢吸取上层澄清上清液；
2.上清含有细小菌体碎屑的时候选用0.22 μm水系滤膜缓慢过滤；液体清澈透亮直接跳过过滤工序，避免疏水表面活性代谢物吸附损耗；
3.待测上清放置至30 ℃之后低速超声脱气6?8 min，除去溶液内部微小气泡，超声功率调低，防止活性代谢物受热分解；
4.样品现处理现测，短期存放需要4 ℃冷藏，存放时长不要超过8 h；
5.混匀离心管动作轻柔，禁止剧烈摇晃产生大量气泡。
3.预实验基线验证
取空白发酵培养基上机运行90 min动态张力检测，确认张力曲线平稳，培养基营养组分不会降低水溶液表面张力。
选取1?2株预实验菌株上清测试，确认探针润湿状态正常，仪器能够检出堆肥微生物代谢产物造成的表面张力下降。
叁、标准化上机检测完整操作流程
1.单通道贰辫蝉颈濒辞苍精细检测流程
每一批筛查随机抽取部分菌株作为代表性样品。吸取150 μL脱气后的发酵上清，沿着石英样品杯内壁缓慢加注，液面不可出现气泡，产生气泡则作废重新制备样品。
样品杯安放于帕尔贴恒温基座，关闭防风罩静置10 min，稳定气?液界面。
开启动态表面张力采集程序，采集时长90 min，保存张力?时间曲线，读取吸附饱和后的平衡表面张力。
样品检测完毕之后火焰灼烧探针清除附着物，废液倒掉、容器清洗晾干之后测试下一份样品。
2.顿别濒迟补?8高通量大批量菌株筛查流程
1.依照编号顺序将所有菌株的发酵上清添加进384孔低吸附微孔板，单孔添加50 μL待测上清；
2.微孔板加盖恒温静置平衡25 min，减少水分挥发；
3.将微孔板放置恒温载板，启动自动序列检测，每个微孔重复检测叁次，取平均值作为该菌株上清平衡表面张力；
4.整块微孔板检测结束之后开启探针阵列高温灼烧清洁；每隔二十个样品设置空白培养基对照孔，实时监控基线漂移。
3.平行样品质控标准
同一菌株三份平行上清测得的平衡表面张力差值大于0.5 mN/m时，样品重新离心、脱气复测。全部待测菌株样品的检测温度、静置时长、探针参数保持统一，保证筛查数据具备可比性。
4.实验收尾和仪器养护
大批量菌株筛查结束之后反复灼烧探针，清理顽固的胞外聚合物、脂类残留物；微孔板、样品杯乙醇浸泡之后纯水冲洗晾干。导出每一株菌株对应的平衡表面张力、动态吸附曲线，做好菌株编号对应记录；探针放置防尘干燥存放。
四、数据处理与优良产活菌株筛选
1.关键界面参数提取
提取吸附诱导时长、张力下降速率、平衡表面张力；以菌株编号为横轴、平衡表面张力作为纵轴制作数据表。水溶液平衡表面张力越低，则该菌株胞外代谢物界面活性越强。
2.菌株活性分级筛查
将所有待测菌株划分等级，表面张力下降幅度最大的前部分菌株判定为高活性产表面活性剂菌种；表面张力和空白培养基接近的菌株判定为低活性菌株。
对比张力下降速率，数值越快代表胞外两亲物质吸附至气?液界面的速度更快。
3.后续试验规划
初筛得到的优势菌株，可以继续开展发酵动力学、不同辫贬以及盐度耐受性、代谢产物组分鉴定等后续试验。
五、关键实验控制要点
1.堆肥微生物代谢产物成分复杂，黏性多糖、腐殖质、脂类极易粘附探针，每一次检测结束都需要灼烧清洁探针；样品按照编号顺序依次检测，减少高活性样品残留污染低活性菌株上清。
2.全程恒定检测温度，温度改变会影响代谢物分子扩散速度、胶束聚集状态，干扰多组菌株之间对比结果。
3.全部菌株的培养周期、培养基、转速、温度保持一致，培养条件不一致则筛查结果没有参考意义。
4.禁止剧烈震荡发酵上清，气泡会消耗溶液当中两亲性代谢物，造成动态吸附曲线失真。
5.上清清澈就跳过过滤操作，疏水脂肽、糖脂容易吸附在滤膜，造成测得表面张力偏高，误判菌株活性。
6.堆肥上清含有微量腐殖颗粒，长时间检测留意样品状态，出现悬浮颗粒析出时更换新鲜待测液。
