一、实验目的
本方案针对大批量油田来源分离菌株进行培养，利用芬兰碍颈产谤辞苍?顿别濒迟补?8高通量表面张力检测仪完成快速初筛，依靠发酵上清油水界面张力、气?液表面张力数值，初步筛选能够分泌生物表面活性剂、具备原油降解潜力的功能菌株。
原油属于疏水有机物质，微生物分泌的糖脂、脂肽类胞外活性剂可以降低油水界面张力，乳化分散原油，为菌体接触、降解石油烃创造条件。界面张力越低代表菌株代谢产物乳化原油的能力越强；该初筛方式无需复杂的原油降解定量检测，可以一次性处理上百份菌株样品，缩减大规模菌种筛选的工作量。
二、实验前期准备
1.仪器与耗材准备
核心仪器选用芬兰Kibron Delta?8高通量表面张力分析仪，负责大批量菌株样品快速筛查；搭配Epsilon动态界面张力仪用于初筛优势菌株做动态吸附曲线复核；配置Wilhelmy合金探针、帕尔贴恒温样品基座、石英微量样品杯、384孔低吸附微孔板、探针火焰灼烧清洁组件、仪器配套采集软件。
辅助设备包含超净工作台、恒温振荡摇床、高速冷冻离心机、pH计、0.22 μm低吸附水系滤膜、超声清洗仪、无菌离心管、一次性无菌取样管。
实验耗材为油田污泥、油水样本分离得到的全部待测菌株、以原油为唯一碳源的筛选培养液、磷酸盐缓冲液、酸碱调节剂、18.2 MΩ超纯水、无水乙醇、异丙醇、油田现场原油。
仪器预处理规范
整机通电预热30 min，检测温度设置30 ℃，和降解菌株摇瓶培养温度保持恒定。
合金探针每一次样品检测之前使用丁烷火焰灼烧，清除探针表面粘附的脂类、胞外多糖残留物，冷却之后执行零点校准；纯水的平衡表面张力稳定处于71.8~72.2 mN/m，基线连续30 min波动小于0.2 mN/m之后再开启检测工作。
微量样品杯、384孔微孔板依次异丙醇擦拭、无水乙醇冲洗、超纯水多次润洗之后氮气吹干；操作期间手部禁止触碰容器内壁，防止油脂污染气?液、油水界面。仪器放置减震台面，关闭防风防护罩，减少样品水分蒸发和挥发。
2.菌株培育、实验组搭建以及发酵上清预处理
大规模菌株活化和摇瓶培养
所有从油田环境分离获得的候选菌株，在固体平板完成传代活化；之后转接至原油唯一碳源液体培养基。每一株菌种设置叁组生物学平行摇瓶；空白对照组设置未接入菌株的原油无菌培养液，放置在相同摇床环境同步培养。
全部摇瓶统一培养转速、温度、发酵时长，保证所有菌株培养条件一致，消除培养环境带来的实验误差。
发酵上清预处理
1.培养结束之后取出菌液，8000 r/min常温离心15 min，沉降菌体、原油悬浮颗粒和固体杂质，缓慢吸取上层澄清发酵上清；
2.上清当中残留细小油滴和菌体碎屑的时候选用低吸附水系滤膜缓慢过滤；液体清澈透亮直接跳过过滤工序，避免疏水生物表面活性剂被滤膜吸附损耗；
3.待测上清放置至30 ℃恒温之后低速超声脱气6?8 min，调低超声功率，防止高温造成表面活性物质分解；
4.样品现处理现测，短期存放条件为4 ℃冷藏，存放时长不能超过8 h；
5.颠倒离心管的时候动作轻柔，禁止剧烈摇晃产生大量气泡以及乳化油滴。
3.预实验基线验证
取空白原油培养基上机开展90 min气?液以及油水界面张力测试，确认空白培养液本身不会大幅度降低油水界面张力。
选取2至3株待测菌株上清开展预测试，确认探针润湿正常，仪器可以检出胞外活性剂引发的界面张力下降。
叁、标准化上机检测完整操作流程
1.顿别濒迟补?8高通量大批量菌株初筛流程
1.按照菌株编号顺序将所有待测发酵上清添加进384孔低吸附微孔板，单孔添加50 μL待测上清；
2.微孔板加盖之后恒温静置平衡25 min，减少水分挥发；
3.将微孔板安置在恒温载板，启动仪器自动序列检测程序；优先测定油水界面张力，每一个微孔重复检测叁次，取平均值作为该菌株上清界面张力结果；
4.整块微孔板检测结束之后开启探针阵列高温灼烧清洁；每隔二十个样品孔放置空白培养基对照孔，用来实时监控基线漂移情况。
2.贰辫蝉颈濒辞苍仪器对候选优势菌株精细复核
高通量筛查结束之后，挑选界面张力较低的潜力菌株，使用单通道贰辫蝉颈濒辞苍动态界面张力仪测定完整的张力?时间吸附动力学曲线。
吸取150 μL脱气后的发酵上清沿着石英样品杯内壁缓慢加注，液面不可出现气泡。样品杯安放于帕尔贴恒温基座，关闭防风罩静置10 min。
开启采集程序，采集时长设置90 min，保存动态吸附曲线，读取平衡油水界面张力数值。
单份样品检测结束之后火焰灼烧探针清除油污和黏性代谢残留物，废液倒掉、容器清洗晾干之后继续下一组样品检测。
3.平行样品质控标准
同一菌株三份平行上清测得的油水平衡界面张力差值大于0.5 mN/m，样品需要重新离心、脱气之后复测。全部待测菌株样品检测温度、静置时长、探针下落参数保持统一，保障多组菌株的数据具备横向对比条件。
4.实验收尾和仪器养护
大规模菌株筛查工作结束之后反复灼烧探针，清理顽固油相附着物、胞外聚合物残留；微孔板、样品杯使用有机溶剂浸泡除油之后纯水冲洗晾干。导出每一株菌株对应的油水界面张力和气液表面张力数据，绑定对应的菌株编号；探针放置干燥防尘环境存放。
四、数据处理、原油降解潜力菌株筛选标准
1.关键界面参数提取
提取界面吸附诱导时长、张力下降速率、气?液平衡表面张力、油水界面张力，整理成菌株?界面张力数据表。油水界面张力数值越低，菌株分泌出的生物表面活性剂乳化原油的性能越强。
2.菌株分级初筛
按照油水界面张力数值划分等级，筛选出界面张力最低的一批菌株当作优势候选菌种；油水界面张力和空白对照组接近的菌株判定为低活性菌株直接筛除。
对比张力下降速率，下降速度越快代表胞外两亲物质可以快速铺展至油水界面，乳化响应速度优异。
3.后续深度试验规划
经过碍颈产谤辞苍张力初筛得到的优势菌株，接下来开展原油烃降解率测定、耐盐耐温测试、发酵条件优化等进阶试验。
五、关键实验控制要点
1.油田菌株发酵上清含有原油油滴、黏性胞外聚合物，油污极易粘附金属探针，每一次检测结束都需要灼烧清洁探针；样品检测顺序依照编号依次筛查，规避高活性代谢物、油污残留污染低活性菌株样品。
2.全程恒定检测温度，温度浮动会改变生物表面活性剂胶束结构、原油黏度，干扰油水界面张力对比结果。
3.所有候选菌株的培养基、碳源、培养周期、摇床转速必须统一，培养条件不一致时，筛查结果不具备可比性。
4.禁止剧烈震荡发酵上清，人为产生的气泡会消耗溶液当中两亲活性分子，造成动态吸附动力学曲线失真。
5.上清液体清澈透亮时跳过滤膜过滤步骤，脂肽、糖脂类疏水活性剂极易被普通滤膜吸附，造成测得界面张力偏高，错过高产活性物质菌株。
6.检测油水界面张力时原油取用油田原位原油，不要使用替代油品，保证筛选条件贴合油田实际环境。
